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蛋白质多肽检测

·蛋白质检测概述
蛋白质谱技术简单来说就是一种将质谱仪用于研究蛋白质的技术。目前,它的基本原理是蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物,在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子,质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(即质荷比,M/Z)的肽段离子分离开来,经过检测器收集分离的离子,确定每个离子的M/Z值。经过质量分析器可分析出每个肽段的M/Z,得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱,即蛋白质的一级质谱峰图。离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析,输出选取肽段的二级质谱峰图,通过和理论上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。

一开始,蛋白质谱通过离子化(Electrospray Ionization,ESI)或者基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)的方法对完整的蛋白质进行离子化后进入质谱分析仪器,这也被称为“top-down”蛋白分析方法。后来,完整的蛋白质通过酶切作用后,分解成多肽混合物,这些混合物进入质谱仪后,通过多肽指纹图谱或串联质谱的方法进行鉴定,这被称为"bottom-up"方法。显然,后者可以从多肽水平实现对蛋白质的分析和鉴定。

蛋白质检测的其他方法

1、凯氏定氮法

这种方法是1883年Kjeldahl发明,当时凯氏只使用H2SO4来分解试样,来定量谷物中的pro,他只知用H2SO4分解试样,而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程,所以只使用H2SO4分解试样,需要较长时间,后来由Gunning加入改进,他改进的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升,这样加快分解速度,因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400℃,提高了不到67℃所以速度也就加快了,凯氏定氮法至今仍在使用。我们在检验食品中pro时,往往只限于测定总氮量,然后乘以pro核算等数,得到蛋白质含量,实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物,故称为粗pro。

2、
水扬酸比色法

原理: 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后,在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物,可以在波长660nm处比色测定,求出样品含氮量,计算蛋白质含量。

3、紫外分光光度法

原理:pro及其降解产物的芳香环基 ,在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收,在280nm下,光吸收与pro浓度(3~8mg/ml)成直线关系,因此,通过测定pro溶液的吸光度,并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品,从标准曲线查出蛋白质的含量。

4、双缩脲法-皮尼克法

原理:双缩脲在碱性条件中,能与CuSO4结合成红紫色的络合物。pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似,也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂,酒石酸钾钠比甘油好些。小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。